基因测序仪可广泛用于基因测定,癌细胞的表达普测定、亲子鉴定、个体识别、基因档案、父系鉴定、母系鉴定、种族鉴定、种属鉴定、传染病毒的测定及胎儿遗传缺陷的分析,比如癌细胞有起固有的表达方式,通过测定可得知人体癌细胞的发生和变化情况。另外,国产第三代基因测序仪的研发将极大地拓宽生命科学、生物化学、生物医药等领域,广泛地应用临床医学、生物能源等。

基因测序仪原理

在分子生物学研究中,基因的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger等。发明的双脱氧链末端终止法。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。Sanger测序法得到了广泛的应用。

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。

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基因测序仪分类

根据电泳类型分为平板型电泳和毛细管电泳两类:

1、平板型电泳:平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中,聚合后厚度一般小于0.4mm或更薄,因此又称为超薄片层凝胶电泳。是经典的电泳技术,具有样品判读序列长(600-900bp)、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序的优点。

2、毛细管电泳:将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中(内径50~100um),在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离。是一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的技术,可测序列达到750bp左右。

发展历史

1、第一代DNA测序技术

1977年,Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法。此后,在Sanger法的基础上,20世纪80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外,90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。

传统的第一代测序技术具有高准确性和简单、快捷等优点,但由于测序通量低,仅适用于小样本遗传疾病基因的鉴定,难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查。

2、第二代DNA测序技术

进入21世纪后,第二代测序技术诞生。主要是将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。然后进行引物杂交和酶延伸反应。经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。

与第一代技术相比,第二代测序技术不仅保持了高准确度,而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。

3、第三代DNA测序技术

第三代测序技术的显著特征是长读长,在保持高准确度的同时可明显将测序读长再提高10-50倍。第三代测序技术解决了第二代测序技术在测序文库制备时所必需的PCR放大过程,一定程度上消除了PCR所引入的系统误差,同时也减少了整体实验运行时间。

4、第四代DNA测序技术

第四代DNA测序技术同样属于单分子测序,但其利用纳米孔芯片检测单分子测序信号的技术原理不再依赖高速摄像机或者高分辨率的CCD相机,最大程度上降低了检测设备的成本。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子从一个孔洞经过时检测到被影响的电流或光信号。由于与第三代测序技术相比具有质的飞跃,通常称之为第四代测序技术。